在现代生物学研究中，荧光显微镜已成为解析细胞和分子结构的重要工具。然而，传统的荧光显微成像受制于激光照明的不均匀性，尤其是在大视野下，限制了高精度定量分析的能力。法国巴黎萨克雷大学的研究团队开发了一种名为ASTER（Adaptable Scanning for Tunable Excitation Regions）的创新照明技术，为解决这一难题带来了全新的解决方案，该成果于2021年发表在《自然通讯》上。

传统技术的局限性

在荧光显微镜中，通常使用激光作为光源，通过在物镜的后焦面聚焦，以生成照亮整个样品的平行光束。然而，这种高斯形状的激光束在视野边缘会出现光强减弱，导致成像区域受限。此外，在单分子定位显微镜（SMLM）等需要高激发强度的技术中，这种不均匀性会导致不同区域荧光闪烁行为的不一致，影响了成像质量和数据的可靠性。

ASTER技术的创新之处

ASTER技术是一种融合了扫描和宽场照明的混合式激发方案。其核心理念是使用快速移动的扫描振镜，在样品平面上扫描生成均匀的平顶光斑。具体来说，激光束首先被聚焦到两个位于物镜后焦面共轭平面内的扫描振镜之间。通过控制扫描振镜的角度变化，激光束在样品平面上进行大范围的X-Y扫描。快速的扫描（可在毫秒内完成）使得在相机曝光时间内，样品平面上形成均匀的照明区域。

图1 使用光栅扫描模式生成均匀场的 ASTER 装置的简化示意图

ASTER的技术优势

1. 均匀的宽场照明：ASTER可以在高达200 µm × 200 µm的视野范围内提供均匀的激发光照，这大大超越了传统高斯激光束约40 µm × 40 µm的有效视野范围。

2. 高兼容性：该技术可与全内反射荧光（TIRF）和倾斜照明（HiLo）等光学切片技术兼容，实现对样品的精确光学切片。这对于研究膜蛋白和细胞粘附等近膜过程非常重要。

3. 降低激光功率需求：由于ASTER提供了局部高激发强度的扫描激发方式，即使在较低的平均激光功率下（<0.3W），也能实现有效的大视场单分子成像，从而无需使用昂贵且危险的高功率激光器。

应用实例

1. 微管的超分辨率成像

研究团队使用ASTER技术对COS-7细胞内的微管进行了STORM成像。在200 µm × 200 µm的视野下，微管结构在整个区域内都得到了清晰的呈现。分析显示，不同区域的荧光子计数、闪烁持续时间和定位密度均保持一致，证明了ASTER在大视野下的均匀性和可靠性。

图2 COS-7细胞中微管的STORM成像

2. 神经元膜蛋白的高精度成像

在对大鼠海马神经元的研究中，ASTER技术成功地捕捉到了轴突中β2-谱蛋白的周期性结构。通过在大视野下的成像，研究人员能够观察到长达数百微米的轴突段，揭示了神经元细胞骨架的精细组织。这对于理解神经信号传导和细胞内运输等过程具有重要意义。

3. 网格蛋白包被小窝的定量分析

利用ASTER的高通量成像能力，研究人员在一次实验中获取了约20,000个单独的网格蛋白簇数据。通过对这些数据的聚类分析，成功区分了不同大小和形状的网格蛋白结构，为深入了解细胞内吞作用机制提供了丰富的数据支持。

图3 ASTER 在单分子定位显微镜中的应用

未来展望

ASTER技术的出现，为荧光显微成像领域带来了革命性的变化。其在大视野下实现高分辨率和高均匀性的能力，将推动细胞生物学、神经科学和分子生物学等领域的研究。未来，ASTER有望与其他先进技术相结合，如多色成像和三维重建，实现更广泛的应用。此外，ASTER的原理也可推广至其他需要均匀光照的大面积成像技术中，为科研工作者提供更加灵活和高效的工具。

文献原网址：https://www.nature.com/articles/s41467-021-23405-4

[注：本文内容基于《自然通讯》杂志上发表的论文，版权归原作者所有。]