引言

神经元在其自然状态下的功能和形态的动态变化可以支撑动物的自然行为。超分辨显微成像技术具有更细节地揭示这些动态变化的潜能，但受制于严重的运动伪影从而很难应用于行为动物中。中国科学院脑认知与类脑智能重点实验室的王凯团队提出了一种多路复用线扫描结构光照明显微成像技术：MLS-SIM (Multiplexed, line-scanning, structured illumination microscopy), 实现容忍速度至50 μm/s的超分辨成像。此文献于2024年11月发表于Nature Methods期刊，题目为“Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons

in behaving animals”。

背景介绍

在动物的生命进程中，神经元的形态持续性变化以实现动物的行为适应，这对动物在不同环境下的生存至关重要。很多超分辨成像手段被应用于观察更精细的结构和形态，例如结构光照明显微技术曾被应用于麻醉小鼠脑部成像，其运动伪影可被计算校正。然而，始终缺少一种超分辨成像手段对清醒和行为中动物脑补神经元形态变化进行追踪以应对麻醉给神经元生理学带来的变化。

MLS-SIM技术原理

l  光路设计：MLS-SIM基于线扫描共聚焦显微的结构骨架，采用多路复用的方法，通过柱透镜及相位光栅产生聚焦的线状图案和具有周期性强度调制的线状图案两种照明模式，前者可在y方向上提升分辨率，后者可在x和z方向上提升分辨率。并通过一维压电偏转镜对样本平面y方向进行持续扫描的同时快速切换两种照明图案，实现对三维方向上的超分辨信息收集。

l  超分辨重建算法：MLS-SIM设计了独特的像素重分配与联合解卷积算法，实现40Χ，NA=1.14物镜下的横向150nm左右的分辨率。并采用多层重建算法，实现轴向上对在焦平面的最佳重建，得到450nm左右的轴向分辨率，也称为超分辨光学层切。

MLS-SIM技术优势

l  可通过沿一个方向的一次性扫描实现三维超分辨成像

l  更好地容忍样本运动

l  更长时程的成像

图1 MLS-SIM成像原理示意与超分辨成像

应用实例

l  清醒小鼠脑部神经元的快速形态变化成像

MLS-SIM可以对清醒小鼠脑部树突棘进行持续性拍摄，并捕捉树突棘上微刺的出现和消失现象。文章统计了微刺出现的频率、寿命、伸展长度、以及重复出现的数量。

图2 清醒小鼠脑部神经元的快速形态变化成像

l  清醒/睡眠循环小鼠脑部神经元形态变化追踪

MLS-SIM可用于研究小鼠脑补神经元形态变化在清醒与睡眠状态下的区别。文章对小鼠清醒、眼球快速运动睡眠、眼球非快速运动睡眠状态下的树突棘与轴突结中微小的形态变化进行统计，并发现睡眠和清醒状态下神经元的形态变化无明显不同。

图3 清醒/睡眠循环小鼠脑部神经元形态变化追踪

l  PSD-95蛋白定位

PSD-95蛋白是突触成熟和棘稳固的标志。MLS-SIM可对PSD-95蛋白与神经元进行双色成像，对PSD-95在树突上分布的位置及形态进行统计分析，并发现树突上出现活跃形态变化的位置与PSD-95聚集位置高度相关。

图4 清醒小鼠脑部神经元与PSD-95蛋白双色成像

结果讨论

MLS-SIM在光路与算法两方面进行创新，通过多路复用两种互补的线状调制照明图案的快速切换，可实现沿一个方向单次扫描后得到三维超分辨成像，并对快速运动的样本具有非常好的抵抗性，可以被广泛地应用于清醒动物的神经元动态研究中。

原文链接

Zhang, Y., Bai, L., Wang, X. et al. Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals. Nat Methods (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02535-9