研究背景

荧光显微镜是生命科学研究中的关键工具。通过点扩散函数工程，可以在保留视场和时间分辨率的同时，通过在荧光分子出现的图案中编码额外信息来增加成像信息通量，实现多色成像。然而，传统的扩散函数工程方法存在一些局限性，如需要自适应光学元件（如空间光调制器，SLM）或必须为特定波长范围和仪器仔细设计和制造的定制光学元件。此外，以往的方法往往还需要大量的数据分析解调来获得最终的多色成像。2024年7月17日，比利时鲁汶大学化学系的Peter Dedecker教授在Nature Methods期刊发表了题为Simultaneous multicolor fluorescence imaging using PSF splitting的研究文章。作者提出了一种通过分割原始点扩散函数在荧光成像中编码更多信息的方法，解决了上述问题的限制。

技术原理

本研究提出了一种通过分裂原始点扩散函数来编码更多信息的方法，称为点扩散函数复制分离技术，如图1a所示。该方法的核心思想是将荧光分子的发射光分成两个或多个具有相同形状的原始点扩散函数实例，每个实例位于图像中的不同位置。所需的信息可以编码在这些实例的数量、相对方向和相对强度中。这种方法的优势在于：

1宽带操作：由于保留了波前的形状且不会降低原始点扩散函数的锐度，因此支持宽带操作。

2兼容性：不干扰其他类型的PSF工程。

3分析工具：不需要新的图像分析工具。

4定位精度：理论上，这种点扩散函数工程的定位精度与单色成像的点扩散函数相同。

为了实现这一技术，研究人员开发了一种名为“Circulator”的光学器件，如图1b所示。该器件仅使用简单的光学组件，通过偏振分束器将未极化的发射光分成两束等强度的光，每束光通过四分之一波片反射回偏振分束器，并最终成像到相机上。根据发射光的波长和反射镜的反射率，可以得到具有不同相对强度的点扩散函数实例。

图1. a. 示意图显示了本工作提出的基于复制分离的点扩散函数工程策略和基于点扩散函数形状连续变化的更经典的策略。b. Circulator及其组件的光路图。插图显示了不同荧光团的未改性PSF形状和相应的环行器PSF之间的比较。

技术应用

作者随后展示了这项技术在超分辨荧光成像中的应用，使用Circulator实现了三色DNA-PAINT成像。DNA-PAINT是一种基于单分子定位的超分辨率成像技术，能够精确解析纳米尺度的生物结构。通过同时激发和成像微管（标记为ATTO643）、波形蛋白（标记为Abberior Star 488）和网格蛋白（标记为Cy3B）三种不同颜色的荧光分子，研究人员成功获得了高分辨率的多色图像，如图2所示。成像速度相比传统的顺序成像方法提高了三倍，同时保留了完整的视场。Circulator通过生成具有不同相对位置和强度的点扩散函数实例，使得每种颜色的荧光分子在图像上呈现出独特的图案。通过分析这些图案，研究人员可以轻松地区分不同颜色的荧光分子，从而实现同时多色成像。

作者还展示了Circulator在超分辨率光学波动成像（SOFI）中的应用，如图3所示。SOFI是一种利用荧光波动进行超分辨率成像的技术，能够在不增加硬件复杂性的情况下提高成像分辨率。研究人员将Circulator与SOFI结合，实现了多色高分辨率成像。在高荧光分子密度下，传统的超分辨率成像技术往往面临挑战。然而，通过Circulator生成的多PSF图案，研究人员能够选择性地提取具有特定PSF形状的荧光分子，从而在高密度下实现高质量的多色成像。这种方法特别适用于需要同时成像多种生物标记物的应用场景。

图2 使用Circulator实现快速三色DNA-PIANT超分辨成像。

图3 a用Circulator进行基于SOFI成像。 b通过计算所有获取到的荧光图像的平均值得到的荧光图像。c对细胞中的微管、波形蛋白和网格蛋白分别ATTO643、Abberior Star 488和Cy3B标记后，进行一次采集所获得的SOFI图像。图像采集时间：100秒。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02383-7